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堿性淀粉酶的異源表達及分子改造
來源：楊海泉 瀏覽 1664 次 發布時間:2022-10-21
堿性淀粉酶是一種在堿性環境（pH9.0~11.0）下穩定且可以通過裂解α-1,4-糖苷鍵高效水解淀粉的水解酶。堿性淀粉酶可以應用于紡織退漿、洗滌劑添加等領域。研究發現，堿性淀粉酶在紡織退漿領域中應用可以節省大量時間、降低環境污染，同時可以將對紡織織物本身造成的損壞降至最低程度。這極大提高了紡織物前處理過程中的效率，實現最大生產經濟效益，是推動未來紡織物前處理工藝快速發展的關鍵酶制劑之一。
國內外對堿性淀粉酶的研究主要集中在生產菌株篩選、酶的分離純化和酶學性質研究方面。堿性淀粉酶在紡織退漿工藝和洗滌劑添加過程中應用時，需要堿性淀粉酶具有強耐氧化特性和高催化效率。但野生型堿性淀粉酶的耐氧化性能差，催化效率低，需要通過分子改造提高其耐氧化性能及催化效率。
本論文實現了堿性淀粉酶基因（Accession No. AY268953）分別在大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統中的異源表達，并在此基礎上通過對堿性淀粉酶進行分子改造提高了其耐氧化特性和催化效率。
主要結果如下：
1.根據不同宿主密碼子偏好性分別優化了堿性淀粉酶密碼子，并在宿主E. coli、B.subtilis、P. pastoris中成功表達。純化后，測定堿性淀粉酶動力學參數，分析發現該酶的催化效率與已報道其他堿性淀粉酶相比較偏高，適合進一步應用研究。堿性淀粉酶的最適反應pH值為9.5，穩定pH范圍為8.0~11.0。酶的最適反應溫度為50℃，活化能（Ea）為36.1kJ/mol。酶在50和60℃溫度下半衰期（t1/2）分別為15.5和3.2min，酶的熔解溫度（Tm值）為64.3℃。1mM Na~+對堿性淀粉酶酶活力有激活作用，但其他金屬離子對酶活力均沒有促進作用。非離子表面活性劑對堿性淀粉酶穩定性影響較小，但陰離子表面活性劑SDS（十二烷基硫酸鈉）可完全抑制酶的活性。液態洗滌劑和固態皂類洗滌劑對堿性淀粉酶酶活力抑制作用較強，但固態洗衣粉對酶活力影響較小。
2.通過在線模擬軟件Swiss Model對堿性淀粉酶AmyK進行同源模擬，獲得堿性淀粉酶3-D結構。分析酶3-D結構后，確定了活性位點周圍5個關鍵甲硫氨酸殘基（Met145、Met214、Met229、Met247、Met317）。采用單點突變方式，將關鍵氨基酸分別突變成亮氨酸后，突變體耐氧化性顯著提高，但僅突變體M247L催化效率有提高。同時，突變體M247L的pH穩定性和熱穩定性增強。單點突變對酶表面活性劑耐受性沒有顯著影響。突變體M247L與商業洗滌劑（洗衣粉）的兼容性增強。復合突變后，突變體的耐氧化性顯著提高，特別是含有Met247位點突變方式產生的突變體。復合突變體M145-214L、M145-214-229L、M145-229-247L、M214-229-247L、M145-214-229-317L的底物結合能力加強。
3.基于同源模擬獲得的3-D結構，通過單點突變方式分別將5個關鍵氨基酸突變成蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸、異亮氨酸。突變體的耐氧化性顯著增強。突變體M247T、M145I、M229T的kcat/Km值分別提高至改造前酶的1.3、1.5和2.1倍。通過對單點突變體耐氧化和催化效率變化綜合分析，確定了8種正向單點突變方式（M145A、M145I、M214A、M229A、M229T、M247T、M247L、M317I）。通過上述8種突變方式系統進行復合突變，共獲得8個五點突變體。其中，M145I-214A-229T-247T-317I的酶學性質提高最為顯著：kcat/Km值提高為改造前酶的3.2倍；耐氧化性、耐堿性、熱穩定性、表面活性劑穩定性和固態洗滌劑兼容性均增強。
4.將6條具有不同性質的寡肽與堿性淀粉酶N端分別融合后，在宿主E. coli BL21（DE3）中成功表達。融合寡肽1（AEAEAKAKAEAEAKAK）后，AmyK::OP1的比酶活提高為融合前酶的2.4倍。融合蛋白的Km值均減小，說明酶底物結合能力增強。AmyK::OP1的kcat值提高為融合前酶的3.4倍；同時，AmyK::OP1的kcat/Km值提高為融合前酶的5.4倍。融合后，融合蛋白的耐堿性增強。寡肽1、3、4或5與堿性淀粉酶融合表達后，酶的最適反應溫度提高。融合蛋白AmyK::OP1的熱穩定性和耐氧化性增強。洗衣粉對AmyK::OP1的酶活力具有激活作用；同時，其他融合蛋白與洗衣粉的兼容性也較高。融合蛋白在固態皂類和液態洗滌劑存在條件下穩定性均較低。
5.基于對堿性淀粉酶結構區域和氨基酸序列解析，確定了12種酶C端或N端不同截斷方式，并在截斷突變體N端融合表達寡肽1，共產生了24個突變體。堿性淀粉酶C端或N端截斷后，突變體AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的比酶活分別提高為截斷前酶的3.2和2.7倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat值均提高為截斷前酶的2倍。AmyKΔC500-587和AmyKΔC492-587的kcat/Km值分別提高為截斷前酶的3.4和2.6倍。截斷后N端寡肽融合突變體AmyKΔC500-587::SOP和AmyKΔC492-587::SOP的kcat/Km值分別提高為截斷融合前酶的29.7和22.5倍。C端淀粉結合區域對堿性淀粉酶降解玉米淀粉具有重要意義，但N端序列截斷對堿性淀粉酶降解玉米淀粉能力沒有影響。寡肽1融合表達對C端截斷突變體降解玉米淀粉具有促進作用，但對N端截斷突變體降解玉米淀粉的能力基本沒有影響。隨機截斷和截斷后融合表達對堿性淀粉酶pH穩定性和溫度穩定性幾乎沒有影響。突變體AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP的耐氧化性增強。隨機截斷和截斷后融合表達對堿性淀粉酶表面活性劑穩定性沒有顯著影響。突變體AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP與固態洗滌劑（洗衣粉）的兼容性增強。